【目的】研究 ClO?處理對(duì)厚皮甜瓜果實(shí)采后愈傷的影響為厚皮甜瓜的采后愈傷提供方法和理論依據(jù)。

【方法】以‘瑪瑙’厚皮甜瓜為試材，人工模擬損傷后，用25 mg/L的ClO?浸泡損傷果實(shí) 10min，于常溫黑暗條件下進(jìn)行愈傷。測(cè)定愈傷期間損傷果實(shí)的失重率以及損傷接種粉紅單端孢果實(shí)的病情指數(shù)，通過甲苯胺藍(lán)和間苯三酚—鹽酸染色法觀察聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素在傷口部位的積累，并用 IS Capture 圖像軟件對(duì)聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素積累量進(jìn)行分析。測(cè)定傷口表面的色度值，分析傷口處組織愈傷期間苯丙烷代謝活性以及過氧化物酶和多酚氧化酶的活性變化。

【結(jié)果】ClO?處理顯著降低了損傷果實(shí)的失重率和損傷接種果實(shí)的病情指數(shù)，愈傷第7天時(shí)，處理比對(duì)照低10.3%。果實(shí)在損傷后不同時(shí)間段接種粉紅單端孢，經(jīng)1周培養(yǎng)觀察，處理果實(shí)的病情指數(shù)顯著低于對(duì)照，第7 天時(shí)處理果實(shí)的病情指數(shù)比對(duì)照低 56.9%。處理顯著促進(jìn)了果實(shí)傷口處聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素的積累，處理果實(shí)的積累量在愈傷的中后期顯著高于對(duì)照，三者比對(duì)照分別高25.3%、77.7%和35.5%。愈傷期間，處理果實(shí)傷口處的L*值顯著低于對(duì)照，b*值顯著高于對(duì)照，在愈傷第5 天時(shí)，處理果實(shí)的L*值比對(duì)照低6.1%，第3天時(shí)的b*值比對(duì)照高17.8%。處理明顯提高了果實(shí)傷口處的苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性，在愈傷第7天時(shí)，處理果實(shí)傷口處的苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性分別高于對(duì)照 34.3%、80.5%和 15.7%。此外，處理果實(shí)傷口處的總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量也顯著高于對(duì)照，第7天時(shí)，分別高于對(duì)照14.7%、16.8%和 15.6%。

【結(jié)論】ClO?處理可有效促進(jìn)厚皮甜瓜果實(shí)的采后愈傷，ClO?對(duì)愈傷的促進(jìn)作用與激活傷口處的苯丙烷代謝，提高POD和PPO活性，促進(jìn)軟木脂和木質(zhì)素的積累密切相關(guān)。

       【研究意義】厚皮甜瓜(Cucumis melonL.) 是我國西北地區(qū)特色水果，由于果實(shí)個(gè)體較大，在采收和采后過程中易受機(jī)械損傷，機(jī)械損傷造成的表面?zhèn)跒椴≡锏那秩咎峁┝送ǖ溃觿×瞬珊蟾癄€的發(fā)生。因此，有效降低傷口性病原菌的侵染率是采后厚皮甜瓜亟待解決的問題。前人研究進(jìn)展不同果實(shí)表面形成的傷口具有不同程度的愈合能力，通過在傷口部位積累軟木脂和木質(zhì)素等具有保護(hù)作用的天然聚合物，從而抑制傷口部位水分的大量蒸騰，阻止病原物經(jīng)由傷口的侵入。近期研究發(fā)現(xiàn)，某些化學(xué)藥物還具有促進(jìn)傷口愈合的作用。例如，苯丙噻重氮可以促進(jìn)采后梨果實(shí)的愈傷，脫落酸能提高采后番茄和獼猴桃果實(shí)的愈傷能力。ClO?可殺滅病原物，對(duì)果蔬風(fēng)味和品質(zhì)無明顯影響。有報(bào)道表明，ClO?處理可減輕龍眼和番茄果實(shí)的采后病害，延緩蘋果成熟衰老，減輕采后腐爛。還可一定程度上抑制鮮切哈密瓜的后熟。而 ClO?在減輕采后病害中的作用與增強(qiáng)果實(shí)苯丙烷代謝和提高氧化酶活性密切相關(guān)。

【本研究切入點(diǎn)】雖然已有 ClO?誘導(dǎo)采后果實(shí)抗病性的報(bào)道，但該化合物是否影響厚皮甜瓜果實(shí)采后愈傷尚未見報(bào)道。擬解決的關(guān)鍵問題本研究以“瑪瑙”厚皮甜瓜果實(shí)為試材，用 ClO?處理人工損傷的果實(shí)后在常溫條件下進(jìn)行愈傷，測(cè)定愈傷期間損傷果實(shí)的失重率以及接種果實(shí)的病情指數(shù)，觀察愈傷組織的色度以及聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素的積累變化。分析氧化酶和苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性及其代謝產(chǎn)物的含量。評(píng)價(jià) ClO?處理對(duì)厚皮甜瓜果實(shí)采后愈傷能力的影響，為ClO?處理在厚皮甜瓜的采后應(yīng)用提供方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

供試‘瑪瑙’甜瓜于2017年7月采自甘肅省民勤縣收成鄉(xiāng)露地大田，選取八成熟、外觀整齊、大小一致、無病蟲傷和機(jī)械傷的果實(shí)，單果套網(wǎng)套后裝入瓦楞紙包裝箱，于當(dāng)天運(yùn)抵本實(shí)驗(yàn)室, 在常溫下 (20~25℃, RH70-80%) 貯藏待用。

粉紅單端孢(Trichothecium roseum) 為甘肅厚皮甜瓜產(chǎn)區(qū)最常見的采后病原真菌,由本實(shí)驗(yàn)室提供，于PDA培養(yǎng)基上保存待用。

ClO?有效濃度120mg/g，于4℃冰箱保存。

刮皮刀；恒溫培養(yǎng)箱; 超凈工作臺(tái)；立式壓力蒸汽滅菌鍋; 正置萬能顯微鏡;Ci6x分光光度儀； 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī); 紫外-可見光分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)人工損傷及愈傷

參照姜紅等的方法并進(jìn)行修改。果實(shí)先用清水沖洗，然后用1%的次氯酸鈉浸泡1min 進(jìn)行表面消毒，再用無菌水沖洗，晾干后用刮皮刀在果實(shí)的赤道部位分別刮出4條長30mm、寬30 mm、深2mm 的傷口。在室溫條件下暴露0.5 h后,將損傷的果實(shí)浸入25 mg/L的ClO?浸泡10min,取出晾干后分別裝入打孔的聚乙烯保鮮袋(25cm×40cm,厚度0.02mm),于常溫、避光條件下進(jìn)行愈傷，以清水處理作對(duì)照。每處理用果實(shí)120個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.2 愈傷效果的評(píng)價(jià)

1.2.2.1 失重率及病情指數(shù)的測(cè)定

失重率的測(cè)定采用重量法。每處理用果實(shí)9個(gè)，重復(fù)3次。

病情指數(shù)的測(cè)定參照姜紅等的方法并修改。在培養(yǎng)了1 周的T.roseum培養(yǎng)皿中加入一定量的無菌水，用涂布器刮下孢子用4層紗布過濾至錐形瓶中，在振蕩器上振蕩15 s，經(jīng)過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)配置成濃度為 1×10?個(gè)/mL 的孢子懸浮液。分別在果實(shí)損傷后的第0、1、3、5、7天，用涂布器將20μL配好的孢子懸浮液均勻涂于創(chuàng)口表面，晾干后裝入打孔的聚乙烯保鮮袋中，常溫培養(yǎng)7天后統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。每個(gè)處理用果實(shí)8個(gè)，重復(fù)3次。病情指數(shù)- ∑(高痔物口傷口個(gè)數(shù)x態(tài)減病吸別)×100式中，發(fā)病級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)為：4級(jí)，創(chuàng)口表面全部發(fā)??；3級(jí)，創(chuàng)口表面 3/4 的面積發(fā)??；2級(jí)，創(chuàng)口表面1/2面積發(fā)??；1級(jí)，創(chuàng)口表面 1/4 面積發(fā)??；0級(jí)，創(chuàng)口表面不發(fā)病。

1.2.2.2 聚酚軟木脂、聚酯軟木脂和木質(zhì)素沉積的觀察

聚酚軟木脂(suberin poly phenolic, SPP) 和聚酯軟木脂(suberin poly aliphatic,SPA)的沉積觀察參照ILulai的方法并修改。用不銹鋼刀片垂直傷口表面切成厚0.2~0.3 mm，長和寬各為1 cm左右的薄片。采用如下步驟進(jìn)行染色：用0.1%小檗堿(0.05%甲苯胺藍(lán))染色45 min后, 先吸去染料, 再用蒸餾水和 75%酒精洗2~3 遍, 最后用 95%酒精洗 1~2遍，即脫去染料，緊接著在0.25%甲苯胺藍(lán)(1%中性紅)中放置1~2m in進(jìn)行復(fù)染，最后用蒸餾水和 75%酒精洗去染料，SPP(SPA)即染為紫藍(lán)色。將染好色的薄片置于載玻片上，在顯微鏡下熒光觀察拍照。每個(gè)果實(shí)切片4處，重復(fù)3次。

木質(zhì)素的沉積觀察參照ALBA 等的方法并修改。用不銹鋼刀片垂直傷口表面切成厚0.2~0.3mm,長和寬各為1cm左右的薄片, 滴加1%間苯三酚染色1.5min后再加1~2滴濃鹽酸，木質(zhì)素即染為紅色，置于顯微鏡下觀察拍照。每個(gè)果實(shí)切片4處，重復(fù)3次。

愈傷組織的SPP、SPA 和木質(zhì)化細(xì)胞層的厚度根據(jù)文獻(xiàn)的方法通過IS Capture 圖像軟件進(jìn)行測(cè)量計(jì)算。

1.2.3 愈傷組織色度的測(cè)定

在愈傷的0、1、3、5、7 d用Ci6x 分光光度儀垂直于愈傷組織表面進(jìn)行色度的測(cè)定，依次測(cè)定 L*、a*和b*值，每個(gè)處理測(cè) 12處愈傷組織。

1.2.4 生化測(cè)定取樣

參照BI等的方法。在愈傷的0、1、3、5、7d，用不銹鋼刀片垂直傷口表面下取2~3mm深的傷口組織3g，用錫箔紙包好后用液氮冷凍，在-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶的活性測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL)的測(cè)定參照 Liu等的方法并修改。取冷凍樣品3g, 于5mL 硼酸-硼砂緩沖液(pH8.8, 含40g/L 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP), 2 mmol·L?1乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 和5 mmol·L?1β-巰基乙醇) 中冰浴研磨成漿, 在4℃、12 000×g條件下離心30 min, 上層酶液即為粗酶液。反應(yīng)體系包括: 0.1mL 粗酶液, 3mL 硼酸-硼砂緩沖溶液液 (50mmol/L,pH8.8), 0.5mL食物L(fēng)-苯丙氨酸(20mmol/L), 以蒸餾水為參比, 測(cè)定反應(yīng)體系混合10s 后在290 nm波長處的吸光值作為初始值(OD?)，將混合液在37℃水浴鍋中保溫1 h后在 290 nm波長處的吸光值作為終止值(OD?)。以每小時(shí)吸光值變化值增加0.01 為一個(gè)酶活性單位 (U), 以U/g FW表示。

過氧化物酶(peroxidase,POD) 和多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO) 的測(cè)定參照Li的方法。取冷凍樣品3g, 于5mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液((pH5.5, 含 1mmol/L 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG),4%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone,PVPP) 和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)) 中研磨成漿, 在4℃、12 000×g條件下離心 30min, 收集上層液用即為粗酶液。POD反應(yīng)體系: 3mL25mmol/L 愈創(chuàng)木酚, 0.1mL 酶提取液, 0.2mLH?O?(5mmol/L)。以蒸餾水為參比, 在反應(yīng)進(jìn)行到15s時(shí)測(cè)定混合液在470nm波長處的吸光值2min。以每分鐘吸光值變化值增加1為一個(gè)酶活性單位(U)，以U/gFW 表示,重復(fù)3次。PPO反應(yīng)體系:4mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液(50mmol/L,pH5.5),lmL 鄰苯二酚溶液(50mmol/L), 0.1mL 酶提取液。以蒸餾水為參比, 在反應(yīng)進(jìn)行到15s 時(shí)測(cè)定混合液在420nm波長處的吸光值2min。以每分鐘吸光值變化值增加1為一個(gè)酶活性單位 (U), 以U/mg FW表示。

1.2.6 總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量測(cè)定

總酚和類黃酮的測(cè)定參照Pirie 等的方法并作修改。取冷凍樣品3g，于預(yù)冷的4mL HCL-甲醇溶液中冰浴研磨成漿，在4℃避光條件提取20min，期間搖動(dòng)數(shù)次過濾收集上層清液待用。以 1%HCL-甲醇溶液做為參比，分別測(cè)定濾液在280nm和325nm波長處的吸光度值作為總酚和類黃酮的含量，分別以O(shè)D280·g?1FW 和(  表示。木質(zhì)素的含量測(cè)定參照Yan等的方法進(jìn)行測(cè)定。取冷凍樣品3g，于預(yù)冷5mL95%乙醇中研磨成漿，在4℃, 14000×g條件下離心30min, 棄去上清液, 將沉淀物依次用95%乙醇, 乙醇(V):正己烷(V)=1：2沖洗3次，將清洗后的沉淀物在60℃烘箱中干燥24 h后轉(zhuǎn)移至離心管中,溶于1mL25%溴化乙酰冰醋酸溶液,70℃恒溫水浴30min后加入1mL NaOH(2mol/L)終止反應(yīng)。最后加入2mL冰醋酸和0.1mL鹽酸羥胺(7.5mol/L), 在4℃、12000×g條件下離心 30 min, 取上清液0.5mL并用冰醋酸定容至5mL, 在280nm波長處測(cè)定吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

上述測(cè)定均重復(fù)3次。全部數(shù)據(jù)用Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE),用SPSS 19.0進(jìn)行 Duncan’s 多重差異顯著性分析及相關(guān)性分析 (P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClO?處理對(duì)愈傷期間果實(shí)失重率和病情指數(shù)的影響

愈傷期間，處理和對(duì)照果實(shí)的失重率均逐漸升高，但處理果實(shí)的失重率顯著低于對(duì)照，第 7 天時(shí),比對(duì)照低 10.3%(P<0.05)(圖 1-A)。處理和對(duì)照果實(shí)的病情指數(shù)均隨愈傷時(shí)間的延長逐漸下降，處理果實(shí)顯著低于對(duì)照，第7天時(shí)，僅相當(dāng)于對(duì)照的43.1%(P<0.05)

愈傷期間，處理和對(duì)照果實(shí)傷口處的SPP 和SPA積累量均逐漸增加，處理果實(shí)的積累量在愈傷的中后期均顯著高于對(duì)照(圖2-A，B)。SPP和SPA的積累差異分別始于第1天和第3天, 第7 天時(shí) SPP 和 SPA 的積累厚度分別比對(duì)照高25.3%和        

處理和對(duì)照果實(shí)傷口處的木質(zhì)素積累始于愈傷中期。在第7天時(shí)，處理果實(shí)木質(zhì)素的積累厚度比對(duì)照高 35.5%(P<0.05)(圖 3-C)。SPP、SPA 和木質(zhì)素的積累結(jié)果表明, 有效促進(jìn)了厚皮甜瓜果實(shí)傷口處的木栓化。

愈傷期間，處理和對(duì)照果實(shí)傷口處的L*值均先上升后下降，在愈傷的后期顯著低于對(duì)照, 第5天和第7天時(shí),分別比同期對(duì)照低6.1%和5.8%(P<0.05)(圖4-A)。處理和對(duì)照果實(shí)的a*值差異不顯著(結(jié)果未顯示)。兩者b*值總體先降后升，在愈傷的前期和中期顯著高于對(duì)照。第3天時(shí), 比對(duì)照高17.8%(P<0.05)。

處理對(duì)傷口處PAL、POD和 PPO活性以及總酚、類黃酮、木質(zhì)素含量的影響

愈傷期間，處理和對(duì)照果實(shí)傷口處的 PAL 活性均逐漸升高，但處理果實(shí)的 PAL 活性顯著高于對(duì)照, 第7天時(shí), 比對(duì)照高34.3%(P<0.05)(圖5-A)。對(duì)照果實(shí)的POD和PPO 活性隨愈傷時(shí)間的延長逐漸升高，而處理果實(shí)的活性則先略有降低后顯著升高，在愈傷的后期顯著高于對(duì)照,第7天時(shí), POD 和 PPO 活性分別比對(duì)照高80.5%和15.7%(P<0.05)(圖 5-B，C)。處理果實(shí)傷口處的總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量在愈傷期間均呈先降后升的趨勢(shì),在愈傷的后期顯著高于對(duì)照。第7天時(shí),分別比對(duì)照高14.7%、16.8%和15.6%(P<0.05)(圖5-D, E, F)。PAL、POD 和 PPO 活性以及總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的增加結(jié)果表明,  激活了厚皮甜瓜果實(shí)傷口處的苯丙烷代謝以及氧化酶活性。

3 討論

ClO?可通過增強(qiáng)苯丙烷代謝和提高氧化酶活性來誘導(dǎo)果實(shí)的采后抗病性。本研究發(fā)現(xiàn)，ClO?處理可通過激活采后厚皮甜瓜果實(shí)傷口處的苯丙烷代謝及氧化酶活性，加速軟木脂和木質(zhì)素在傷口處的沉積，從而促進(jìn)了厚皮甜瓜果實(shí)的采后愈傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，ClO?處理可顯著提高厚皮甜瓜果實(shí)傷口處的PPO活性。處理果實(shí)傷口處L*值高于對(duì)照，b*值低于對(duì)照的結(jié)果表明，PPO參與了愈傷組織的形成，處理果實(shí)傷口處的L*值在0 d 顯著高于對(duì)照可能源于 ClO?的漂白作用。在愈傷中由于細(xì)胞內(nèi)膜被破壞，液泡中的酚類底物會(huì)和PPO發(fā)生反應(yīng)，氧化為醌，醌再進(jìn)一步聚合為黑色或褐色的物質(zhì)。這些聚合物不僅引起果實(shí)組織褐變，而且可直接抑制病原菌生長，鈍化病原菌分泌的胞外酶，該結(jié)果與 Wei等人在獼猴桃愈傷期間觀察到的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

ClO?采后處理可有效降低損傷果實(shí)的失重率和損傷接種果實(shí)的病情指數(shù)，促進(jìn)了厚皮甜瓜的采后愈傷。ClO?處理對(duì)采后厚皮甜瓜愈傷的促進(jìn)作用與激活果實(shí)苯丙烷代謝，提高POD和PPO活性，促進(jìn)SPP、SPA和木質(zhì)素在傷口處的積累密切相關(guān)。